芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜核因子的医疗发展

溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制迄今尚未明确,其中免疫因素在此病中所起的作用越来越受重视,研究已深入到细胞分子水平,特别是近年来研究发现核因子-B(nuclear factor-kappa B,NF-B)调控着UC患者中细胞因子和细胞黏附分子(cell adhesionmolecules,CAM)的释
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 溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制迄今尚未明确,其中免疫因素在此病中所起的作用越来越受重视,研究已深入到细胞分子水平,特别是近年来研究发现核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)调控着UC患者中细胞因子和细胞黏附分子(cell adhesionmolecules,CAM)的释放,从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应。芍药汤出自《素问病机气宜保命集》,具有清热燥湿、调气和血的功效,根据多年的临床研究,对于胃肠湿热型UC,具有良好的疗效,为求进一步明确芍药汤干预UC调节作用机制,本实验通过检测NF-κB的DNA结合活性,从基因水平探讨芍药汤干预UC的机制。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物
  清洁级SD大鼠40只,体重180~220 g,购自湖南中医药大学动物实验室[合格证号:SCXK(湘)2011~0003],动物适应性饲养1周。
  1.2 实验器材
  核蛋白提取试剂盒(武汉博士德生物公司);BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(西安晶彩生物科技有限公司);Tarns AMTM NF-κB酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海齐一生物物技有限公司);ZFMQ050PE型超纯水器(上海摩勒科学仪器有限公司);3K-30Z型高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。
  1.3 实验阳性对照药物与试剂
  柳氮磺胺吡啶(SASP)(上海福达制药有限公司,批号:201310001,每片0.25 g),三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司),药物用蒸馏水配成50 g/L。
  1.4 实验用药的制备
  芍药汤超微颗粒由芍药、当归、黄连、槟榔、木香、黄芩、大黄、肉桂、甘草9味药组成。组方超微颗粒由湖南春光九汇现代中药有限公司提供,然后在湖南中医药大学附属第二医院制剂科,将药物用蒸馏水制成含生药1.32 g/mL水剂。
  1.5 实验方法
  1.5.1 造模及分组 将40只大鼠随机分为4组,每组各10只,正常组、模型组、芍药汤组、SASP组。除正常组外,其余3组首先参考文献[1-2]复制胃肠湿热模型:以高脂高糖饮食饲养大鼠,即在普通饲料喂养的基础上,加用200 g/L蜂蜜水自由饮用,每隔1 d按大鼠体重灌服油脂10 g/kg,并与油脂一起灌服10 mL/kg白酒,共10 d。然后再放入温度(32±2)℃,相对湿度为95%的人工气候箱中,共5 d。待胃肠湿热型模型造模成功后,再予以TNBS灌肠法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h,除正常组,其余各组大鼠先用乙醚麻醉,然后从肛门将大鼠灌胃针头轻轻插入,避免损伤肠道,深度约为8 cm,推入TNBS溶液(含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇)4 mL/kg体重,捏紧肛门平放5 min即可,术后予以常规饲养。待造模4 d后,随机从每组中抽出1只处死并解剖,游离其结肠组织,用生理盐水洗净后,观察距肛门7~8 cm处见肉眼可辨溃疡面,病理检查发现充血、水肿、隐窝脓肿和典型的溃疡等形成,确定造模成功。
  1.5.2 给药方法与标本留取 确定造模成功后第2天,将大鼠按体表面积折算成成人等效剂量给药,芍药汤组折算后为含生药13.2 g/(kg·d),同理,SASP组折算后为0.5 g/(kg·d)。正常组和模型组大鼠用等体积量生理盐水经胃灌入。每组同时开始按上述剂量给药,1次/d,连续10 d。末次给药24 h后,以脱颈椎法将大鼠处死,提取距肛门8 cm结肠组织,并沿纵轴剪开,在结肠病变最明显处取0.5 cm结肠,以10%甲醛液固定、石蜡包埋,制成病理切片,HE染色后光镜下查看;余下部分刮取结肠黏膜组织,每只大鼠刮取50 mg新鲜结肠黏膜,立即提取核蛋白。利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB P65试剂盒检测各组NF-κB相对活性。
  1.6 观察指标
  ①观察大鼠的体重、大便、食欲、活动度、精神状态等;②结肠大体病理及组织学改变:观察大鼠结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、等情况,观察黏膜有无水肿、糜烂、溃疡、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润等改变;③利用以ELISA为基础的Trans AMTM NF-κB P65试剂盒检测NF-κB的DNA结合活性。
  1.7 统计学方法
  应用SPSS 16.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 大鼠一般情况
  正常组大鼠体重、大便、饮食、活动均正常。其余3组大鼠在造模后3 d内均逐渐出现蜷缩、倦怠懒动、反应迟钝、拱背、便软、便溏等症状,有的黏液便甚至可见肉眼血便。造模第4天每组随机抽出一只处死后取结肠,除正常组外剩下各组结肠组织肉眼可见溃疡面。芍药汤组和阳性对照组在用药4 d以后,上述情况开始逐渐改善,进食量明显增加,伴随体重增加明显,到用药后期时,大便多呈颗粒状,黏液便、血便等基本消失。模型组后期血便等症状有所改善,但大便仍不成形并大便臭秽。
  2.2 结肠大体病理及组织学改变
  正常组大鼠肠黏膜上皮细胞排列整齐,腺体结构规则,各层次构造清楚,没有发现炎症细胞及溃疡(图1 a,封三)。其余组所取结肠组织可见黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡,有的出现瘢痕形成,部分结肠扩张、黏膜皱襞变浅,以模型组最为严重(图1 b,封三)。SASP组和芍药汤组病变明显减轻,可见充血、水肿、糜烂和红色瘢痕(图1 c~d,封三)。
  2.3 NF-κB 活性
  与正常组比较,模型组大鼠NF-κB相对活性明显增高,差异有高度统计学意义(P < 0.01);与模型组比较,芍药汤组大鼠结肠黏膜NF-κB相对活性明显降低,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见表1。
  3 讨论
  UC临床上主要以腹泻为主,排出含有血、脓和黏液的粪便,同时常伴有阵发性结肠痉挛性疼痛,并里急后重,排便后可获缓解。本实验中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出现腹泻、黏液脓血便等症状,肠道主要表现为水肿、充血、糜烂,镜下可见大量中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润,在病理学和免疫学特征上与溃疡性结肠炎病患者相似[3-6]。溃疡性结肠炎是多种因素、多种机制相互作用的结果。同时研究还发现,各种细胞因子能够相互作用形成复杂的细胞因子网络,加重炎性反应,从而导致黏膜损伤,这在溃疡性结肠炎的发生发展中起着十分重要的作用[6-7]。
  有研究表明,许多与炎症和免疫反应关系密切的趋化因

  
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