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高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制

摘要:充足的葡萄糖供给和糖原储备是机体顺利完成高原习服的保证,下面是小编搜集整理的一篇探究高原环境对肝脏糖异生影响的 论文范文 ,供大家阅读查看。 机体发生一系列非遗传的、可逆的代偿性变化以适应高原低压、低氧环境的过程称为高原习服。对于初次进入高原
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  充足的葡萄糖供给和糖原储备是机体顺利完成高原习服的保证,下面是小编搜集整理的一篇探究高原环境对肝脏糖异生影响的论文范文,供大家阅读查看。

  机体发生一系列非遗传的、可逆的代偿性变化以适应高原低压、低氧环境的过程称为高原习服。对于初次进入高原的人群而言,能量产生和利用的平衡是机体顺利适应高原环境的关键。通常高原暴露时间≤2周称为急性高原暴露期,>2周称为慢性高原暴露期。

  人和动物实验表明,在急性高原暴露期,心肌、骨骼肌对葡萄糖的摄取增加,高糖饮食有利于机体尽快适应高原环境[1-3].可见,糖代谢在高原习服过程中具有重要作用。在饥饿、低氧等特殊环境中,机体会通过增加糖异生以保证组织供能。但是,急性或慢性高原暴露情况下机体糖异生过程的变化在国内外少有报道。肝脏是糖异生的主要场所,通过研究肝脏糖异生变化可以间接了解高原环境对机体糖代谢的影响。

  葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6pase)是糖异生的关键酶,催化水解6-磷酸葡萄糖生成葡萄糖,转录因子叉头框蛋白O1(forkheadboxO1,FoxO1)是重要的肝脏糖异生调节因子,腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivedpro-teinkinase,AMPK)在糖代谢和脂代谢中都具有调节作用。本研究通过观察大鼠在海拔4300m高原暴露1、3、7、15、30d时肝脏中G6Pase、FoxO1和肝糖原含量的变化并结合本课题组的前期研究AMPK[4]的变化,以了解高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制。

  1材料和方法

  1.1实验动物及分组健康成年SPF级雄性SD大鼠36只(体质量为220~300g),购自西安交通大学医学动物实验中心。将实验动物随机分为6组,每组6只:平原对照组(C组),在平原动物房内饲养(海拔400m);高原暴露1d组(H1)、3d组(H3)、7d组(H7)、15d组(H15)、30d组(H30),分别在海拔4300m的高原动物房内饲养1、3、7、15、30d.动物房温度(22±1)℃,常规大鼠饲料,自由进食摄水,光照约10h/d.

  1.2方法

  1.2.1组织取材及处理饲养到规定时间,禁食不禁水12h,将大鼠麻醉后处死。心脏采血2ml,分离血浆,-20℃保存备用。迅速分离肝组织,立即置于液氮保存,随后移至-80℃保存。

  1.2.2RT-PCR方法检测肝脏G6Pase、FoxO1mR-NA表达(1)采用TRIzol一步法提取肝脏总RNA,测定其纯度及浓度。设计并合成RT-PCR引物:G6Pase上游引物:5'-AACGTCTGTCTGTCCCGGATC-TA-3',下游引物:5'-CCTCTGGAGGCTGGCATTGTA-3',扩增长度为132bp;FoxO1上游引物:5'-CCTACT-TCAAGGATAAGGGCGACA-3',下游引物:5'-CTGGAT-TGAGCATCCACCAAGA-3',扩增长度为141bp;β-Actin上游引物:5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGC-CAAC-3',下游引物:5'-ATGGAGCCACCGATCCA-CA-3',扩增长度为97bp.(2)反转录条件为37℃15min,85℃5s,分装反转录后的cDNA,于-80℃保存。(3)RT-PCR反应程序(两步法):预变性95℃30s,PCR条件:95℃50s,60℃30s,40个循环,72℃熔解10min.采用β-actin做内参对照。总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司。

  1.2.3WesternBlot法检测肝脏G6Pase、FoxO1表达(1)提取肝组织蛋白:采用BCA法测定肝组织蛋白浓度。(2)电泳转膜及抗体孵育:将经过变性的蛋白质进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗4℃过夜(兔抗大鼠多克隆G6Pase抗体购自SANTACRUZ公司,兔抗大鼠多克隆FoxO1抗体购自Bio-worldTechnologyInc.,兔抗人β-actin多克隆抗体购自北京奥博森生物技术有限公司;抗体稀释度分别为β-actin1∶1000、G6Pase1∶500、FoxO11∶500、AMPK1∶500),二抗孵育。(3)显影及定影:ECL显影及定影。(4)分析:使用凝胶图象处理系统自动分析目标条带的分子量和净光密度值,目的蛋白光密度值与内参β-actin光密度值的比值代表定量值。

  1.2.4分光光度法测定肝糖原含量采用肝糖原测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所),按照试剂盒说明书操作。计算公式:糖原含量(mg/g组织)=(测定管OD值/标准管OD值)×10/1.11.

  1.2.5血糖测定使用自动生化分析仪(德国罗氏)检测。

  1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用One-WayANOVA方差分析进行多组间比较,进一步两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

  2结果

  2.1高原暴露大鼠肝脏G6PasemRNA和蛋白表达水平变化与C组比较,大鼠肝组织中G6Pase的mRNA表达水平在H1、H3和H7组显着增高(q值分别为6.52、9.13、4.88,P值均<0.05),H15和H30组无明显变化(q值分别为0.229、0.997,P值均>0.05),G6Pase蛋白表达水平具有相同的趋势,H1、H3和H7组显着增高(q值分别为9.75、13.5、9.41,P值均<0.01);H15和H30组无明显变化(q值分别为1.93、0.371,P值均>0.05)(图1a,b).

  2.2高原暴露大鼠肝糖原含量和血糖变化与C组比较,H1、H3、H7组大鼠肝糖原含量明显增多(q值分别为7.11、33.3、35.9,P值均<0.001),而H15、H30组无明显变化(q值分别为4.13、0.352,P值均>0.05)(图2a).与C组比较,各高原暴露组大鼠血糖水平差异均无统计学意义(q值分别为0.40、1.88、3.03、0.84、0.05,P值均>0.05)(图2b).

  2.3高原暴露大鼠肝脏FoxO1的mRNA及蛋白表达与C组比较,H3、H7、H15及H30组大鼠肝组织FoxO1的mRNA表达水平明显降低,H15组最低(H3:q=6.38,P<0.01;H7:q=9.24,P<0.001;H15:q=10.3,P<0.001;H30:q=5.04,P<0.05),H30组较H15组显着增加(q=5.21,P<0.05);FoxO1蛋白表达水平趋势相同(q值分别为9.43、12.50、14.30、8.95,P值均<0.001),与H15组比较,H30组蛋白表达水平显着增高(q=5.38,P<0.01)(图3a,b).

  3讨论

  充足的葡萄糖供给和糖原储备是机体顺利完成高原习服的保证[3,5],因此血糖、糖异生和糖原代谢三者的平衡在高原习服中具有重大意义。G6Pase是糖异生的关键酶,FoxO1和AMPK是调节肝脏糖异生途径的重要调节因子,活化的FoxO1通过与G6Pase的基因启动子结合而激活G6Pase转录,促进糖异生过程;活化的AMPK则通过降低FoxO1和G6Pase表达而抑制肝脏糖异生[6-10].另外,肝糖原含量增高可以抑制AMPK活性,而活化的AMPK可以抑制糖原合成[11-16].Vats[17]和Liu等[18]发现高原急性暴露大鼠的肝糖原含量明显升高。但是,有关急、慢性高原暴露对肝脏糖异生的影响及机制的研究在国内外少有报道。

  本研究提示在海拔4300m高原习服过程中,大鼠肝脏糖异生和肝糖原的合成在急性暴露期非常活跃,并且持续时间较长,至少7d,慢性暴露期糖异生、糖原合成降至平原对照组水平;血糖水平保持平衡不变。这说明机体在高原暴露急性期通过活跃的糖异生和糖原合成维持机体血糖稳定,从而保障急性低压低氧暴露时的能量平衡,随着习服时间的延长,机体对能量的需求也逐渐恢复,糖异生及糖原代谢也恢复至平原对照组水平。本研究结果结合作者前期研究表明,作者认为高原环境下机体仍以葡萄糖作为主要供能物质。综上所述,海拔4300m高原习服中(1)葡萄糖的利用和合成始终处于一个动态平衡的状态;(2)高原急性暴露期肝糖异生产生的葡萄糖除了动态维持血糖水平外,大部分还是转化为肝糖原储存起来以备机体利用;(3)碳水化合物是高原习服中主要的供能物质。所以,对于高原习服不顺利或者因为急性高原暴露引起的高原病,可能存在能量代谢的失衡,根据病情提供外源性的葡萄糖补给可能有利于患者的恢复。

  此外,还有些不一致的研究结果,例如,有学者发现急性高原暴露期(海拔6000m)肝糖原减少[19],血糖增高[17],慢性缺氧(海拔6800m)条件下血糖降低[20].Benso等[21]组织9名男性登山者在海拔5200m适应7周,发现慢性习服期间血糖下降。本实验结果与上述研究结果不同,考虑可能与实验设计及实验条件不同有关。

  在本实验中,FoxO1的表达水平在急性高原暴露期逐渐降低,在慢性暴露期则有逐渐升高的趋势。此因子的表达趋势与作者前期研究中AMPK[4]的表达趋势相似。作者推测急性暴露期肝糖原的增高抑制了AMPK的活性,进一步使得G6Pase的表达增高,糖异生作用加强,肝脏葡萄糖生成增加。有意思的是,FoxO1在高原急性暴露期中的表达降低,但其下游靶蛋白G6Pase的表达却高于平原对照组。综合分析,可能是FoxO1和AMPK共同作用于G6Pase的结果,二者的作用相互拮抗,它们的"合力"最终决定了G6Pase的水平,而AMPK和FoxO1何者占主导地位,可能与机体对葡萄糖的需求有关,可能还有其他的信号通路调节AMPK和FoxO1的表达,最终决定它们靶基因G6Pase的表达水平。这种拮抗作用既有利于保持糖异生过程的稳定,同时有利于高原环境下节约能源降低氧耗,可能也是高原习服的机制之一。结合本研究和前期研究[4]发现,急性高原暴露期AMPK对G6Pase的促进作用强于FoxO1对其的抑制作用,从而使得G6Pase的表达增加,糖异生增强;在慢性高原暴露期,FoxO1和AMPK水平仍低于对照组,但两者都有逐渐升高的趋势,而血糖、肝糖原却没有明显变化。

  可见,建立一个更长时间的动物模型,进一步研究FoxO1和AMPK在慢性高原暴露的变化及机制,以及两者对糖代谢的调节机制是极其必要的。

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